2025年12月6日至10日，第67屆美國血液學(xué)會（ASH）年會在美國奧蘭多隆重舉行。會議聚焦臨床血液學(xué)和基礎(chǔ)研究領(lǐng)域的最新進(jìn)展，推動血液病臨床診療和臨床前研究向著更高目標(biāo)前進(jìn)。本期特邀分享陸道培醫(yī)院王卉主任團(tuán)隊的研究成果，涵蓋了16色全光譜流式細(xì)胞術(shù)、細(xì)胞因子加權(quán)評分系統(tǒng)和多時間點免疫譜分析模型等前沿技術(shù)。這些研究為早期精準(zhǔn)診斷、治療反應(yīng)評估和臨床干預(yù)提供了堅實的科學(xué)依據(jù)，展示了技術(shù)創(chuàng)新在血液學(xué)領(lǐng)域的重要應(yīng)用。歡迎廣大讀者深入交流與討論。
01、16色全光譜流式細(xì)胞術(shù)檢測T急淋微小殘留病
標(biāo)題Detection of minimal residual disease in t-cell acute lymphoblastic leukemia by 16-color full-spectrum flow cytometry
中文標(biāo)題：采用16色全譜流式細(xì)胞術(shù)檢測T細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病的微小殘留病（MRD）
第一作者：王卉
通訊作者：王卉
研究背景
流式細(xì)胞術(shù)檢測急性T淋巴細(xì)胞白血?。═-ALL）的微小殘留?。∕RD），存在四個主要制約因素：①TdT、CD99等高覆蓋率的早期標(biāo)志物丟失率高，②容易獲得成熟標(biāo)志；③成熟淋巴細(xì)胞的免疫表型多樣性，尤其是CD4+/CD8+或者CD4-/CD8-T細(xì)胞的干擾；④CD7-嵌合抗原受體修飾的T細(xì)胞（CAR-T）療法的應(yīng)用增加檢測難度。為此，我們采用全光譜流式細(xì)胞術(shù)設(shè)計了一個16色方案，試圖最大程度解決這些問題。
研究方法
2024年2月28日到2025年5月29日，在河北燕達(dá)陸道培醫(yī)院診治的T-ALL患者中，使用全光譜流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行MRD檢測，1025例患者完成1570次檢測，男：女為768:257，中位年齡16歲（1-68）。檢測方案為CD99 FITC/cCD3 PE/CD3 BV785/CD48 PECy7/CD4 APC Cy7/CD5 APC R700/CD2 BV605/CD7 APC/CD16 efluor 450/CD56 BV711/TdT BV421/CD45 V500 /CD34 PerCP Cy5.5 /CD94 BV650 /CD8a BV570/TCRγδ BV480?？傆?12人有可以檢測的基因。選擇完全緩解和MRD陽性各10例進(jìn)行傳統(tǒng)方案和全光譜方案的相關(guān)性測試。采用kaluza2.3.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。采用Fisher的確切概率法進(jìn)行率的比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
研究結(jié)果
1、全光譜流式和傳統(tǒng)流式兩組相關(guān)性好，R2=0.9945。
2、1570次檢測中，陽性標(biāo)本為來自103人的155次檢測。陽性患者中，男女比79:24，中位年齡21歲（4-68歲）。腫瘤負(fù)荷中位數(shù)1.66%(0.002-94.15%)。MRD陽性組68人有可以檢測的融合基因或者原癌基因（表1），重復(fù)檢測患者以腫瘤負(fù)荷高的計算。
表1 68例有可以檢測的融合基因或者原癌基因的T-ALL MRD陽性患者分布
3、CD7 CAR-T后CD7陰性患者52例，MRD陰性組43例，MRD陽性組9例。MRD陽性患者中，cCD3陰性2例，部分陽性4例，CD5陰性2例，CD5dim5例，CD2陰性6例，CD2dim或者部分陽性1例。CD7陰性的52例患者，cCD3、CD2、CD5均陰性率為0（圖1）。丟失cCD3的6例患者中2例CD2和CD5均陰性。
4、MRD隨訪過程中，抗原表達(dá)改變情況（圖2）。
圖2 治療過程中，部分T-ALL MRD陽性患者抗原表達(dá)改變情況
5、遺傳學(xué)與免疫表型的關(guān)系（圖2）。CD45dim/CD7bri是最佳設(shè)門方法，但是需要排除NK細(xì)胞的干擾。MLL::AF6融合基因患者的MRD最容易識別，因為100%表達(dá)CD7briCD99briCD48-CD56-CD34+，其次為EVI1遺傳學(xué)異常病例，100%表達(dá)CD7briCD99briCD48+CD56-CD34+，CALM::AF10融合基因患者100%表達(dá)CD7briCD99briCD48-CD34+, 但是 67% (2/3) 伴有CD56陽性。PCM1::JAK2基因和某些WT1高表達(dá)患者的MRD檢測可能具有挑戰(zhàn)性（圖3）。
圖3 遺傳學(xué)與免疫表型的相關(guān)性分析
研究結(jié)論
全光譜流式細(xì)胞術(shù)的T-ALL MRD檢測方案可以同時做4個以上泛系標(biāo)志，理論上滿足98.51%的CAR-T之后MRD檢測的設(shè)門需要，是一種最有希望的MRD檢測方法。遺傳學(xué)與免疫表型有一定相關(guān)性，不同基因型得益于不同的標(biāo)志物，而全光譜流式同時做更多標(biāo)志物組合，可以最大限度覆蓋各種遺傳學(xué)亞型的常見異常。
02、動態(tài)免疫細(xì)胞亞群與細(xì)胞因子分析可早期鑒別allo-HSCT后急性胃腸道GVHD與病毒性腹瀉
標(biāo)題：A Multi-Timepoint Immune Profiling Model for Differentiating GVHD- and Infection-Associated Diarrhea Following Allo-HSCT
中文標(biāo)題：基于多時間點免疫譜分析模型區(qū)分同種異體造血干細(xì)胞移植后GVHD與感染相關(guān)腹瀉
第一作者：陳曼
通訊作者：王卉
研究背景
異基因造血干細(xì)胞移植（allo-HSCT）是治療高危血液系統(tǒng)惡性腫瘤以及部分非惡性和先天性疾病的有效根治性手段。盡管近年來移植技術(shù)不斷進(jìn)步，移植后非復(fù)發(fā)性死亡率（NRM）仍然較高。移植后腹瀉（post-HSCT diarrhea）發(fā)生率可高達(dá)40%～91%，是最常見的移植相關(guān)并發(fā)癥之一。移植早期腹瀉的病因復(fù)雜多樣，包括感染、化療相關(guān)黏膜炎、藥物毒性及急性移植物抗宿主?。╝GVHD）等。其中，胃腸道GVHD（GI-GVHD）和病毒感染是allo-HSCT受者最常見的兩大原因。由于aGVHD與感染所致腹瀉在臨床表現(xiàn)上高度相似，但治療策略卻完全不同（aGVHD需加強(qiáng)免疫抑制，而感染則需抗病毒治療并減少免疫抑制），因此早期準(zhǔn)確鑒別病因?qū)?yōu)化治療方案至關(guān)重要。
研究目的
本研究旨在通過動態(tài)監(jiān)測移植后淋巴細(xì)胞亞群及細(xì)胞因子水平，構(gòu)建基于免疫特征的預(yù)測模型。
研究方法
本研究為回顧性研究，納入2021年4月至2024年12月在北京陸道培醫(yī)院接受allo-HSCT且出現(xiàn)腹瀉的58例患者。所有患者均完成腸鏡檢查及腸黏膜活檢。病理檢查共確診GI-aGVHD 34例，病毒性腸炎24例（見下圖）。所有患者均納入標(biāo)準(zhǔn)化移植后免疫監(jiān)測流程，并于腹瀉發(fā)生前7天內(nèi)（±3天）完成淋巴細(xì)胞亞群及細(xì)胞因子檢測。排除標(biāo)準(zhǔn)包括：缺乏腹瀉前免疫數(shù)據(jù)、腸鏡檢查禁忌或拒絕接受內(nèi)鏡檢查。隨訪資料通過電話隨訪及病歷系統(tǒng)獲取，生存狀態(tài)截止至2025年5月31日。統(tǒng)計學(xué)分析使用R軟件（版本4.4.3）完成。單時間點（腹瀉前）及多時間點（腹瀉前、第4周和第5周）模型的關(guān)鍵預(yù)測因子通過LASSO回歸和Logistic回歸篩選，并在列線圖、校準(zhǔn)曲線及決策曲線分析中進(jìn)行了驗證。研究方案經(jīng)陸道培醫(yī)學(xué)集團(tuán)倫理委員會批準(zhǔn)（編號：DPEC-M-202108），所有研究對象均簽署知情同意書。
研究結(jié)果
基線資料與臨床特征
在58例造血干細(xì)胞移植后發(fā)生腹瀉的患者中，34例確診為胃腸道GVHD（GI-GVHD，其中15例死亡），24例為病毒性腸炎（8 例死亡）。全隊列共32例男性、26例女性，中位年齡33歲（四分位距，16–49 歲）?；A(chǔ)疾病包括再生障礙性貧血7例、AML 31例、ALL 12例、MDS 8例。GI-GVHD的病理分級分別為I級5例、II級10例、III級14例、IV級5例；感染性腸炎病原包括 CMV 8 例、EBV 9 例、CMV+EBV共感染5例、HHV-6 1例、腺病毒1例。兩組在移植前病程、腹瀉發(fā)生時間、腹瀉持續(xù)時間、有無便血、是否出現(xiàn)高膽紅素血癥以及其他基線臨床特征方面差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P>0.05）。中位隨訪時間為383天（范圍68–1313天），2年總生存率GI-GVHD組為35.2%，病毒性腸炎組為31.8%（P=0.107）。
腹瀉發(fā)生前1周兩組免疫指標(biāo)的差異分析
在腹瀉發(fā)生前1周，GI-GVHD患者的Reg3α水平明顯高于感染組［2205.74 pg/mL（1174.11–3293.06）vs. 1333.70（1058.83–1634.65），P=0.037］，CD3?T%［76.13%（47.45–84.27）vs. 50.33%（34.09–63.18），P=0.005］、CD8?T%（48.29±19.33% vs. 34.53±19.88%，P=0.011）、初始型CD4?/CD4?T%［2.28%（0.75–5.73）vs. 1.06%（0.30–2.19），P=0.021］以及Th2/CD4?T%（40.18±21.11% vs. 27.77±20.61%，P=0.030）亦均顯著升高。與之相反，NK%［17.80%（9.70–40.13）vs. 36.66%（15.46–46.78），P=0.042］及NK細(xì)胞計數(shù)［48.00（22.25–73.25）vs. 80.00（39.00–164.75）cells/μL，P=0.021］在GI-GVHD組顯著降低（圖1A）。效應(yīng)量分析（圖1B）顯示，兩組在CD3?T%上存在較大的效應(yīng)差異，而在CD8?T%、NK細(xì)胞計數(shù)、初始CD4?/CD4?T%、Reg3α和NK%上存在中等程度差異，與箱線圖結(jié)果一致。
圖1. 腹瀉發(fā)生前差異變量的單因素分析；A. 腹瀉發(fā)生前 1 周的差異變量；B. 腹瀉發(fā)生前 1 周差異變量的效應(yīng)量；注：**表示 P<0.01（差異極顯著），表示*P<0.05（差異顯著）
在移植后早期免疫重建階段（移植后第4周和第5周），GVHD與感染患者在相同時間點的多項免疫學(xué)指標(biāo)存在顯著差異
第4周時，GI-GVHD患者的TNFR1水平［1064.26（742.06–1685.01）pg/mL vs. 885.56（556.98–1231.06）pg/mL，P＝0.048］及初始型CD4?/CD4?T%［3.66%（1.49–6.09）vs 1.30%（0.20–4.94），P＝0.039］均高于病毒性腸炎患者，而NK細(xì)胞計數(shù)［58.50（27.50–88.00）vs. 113.00（53.25–173.25）cells/μL，P＝0.023］及Treg細(xì)胞計數(shù)［1.00（0–2.50）vs. 2.50（0.75–4.25）cells/μL，P＝0.016］顯著降低。上述變量呈中等效應(yīng)量，其中NK細(xì)胞計數(shù)及初始型CD4?/CD4?T%的變化趨勢與腹瀉發(fā)生前1周的觀察結(jié)果一致。至移植后第5周，GVHD患者的GM-CSF水平［0.72（0.54–0.97）vs. 0.44（0.33–0.79）pg/mL，P＝0.014］及CD3?CD38?T細(xì)胞計數(shù)［46.00（18.25–190.75）vs. 20.50（4.00–74.25）cells/μL，P＝0.041］繼續(xù)高于感染組，而NK細(xì)胞計數(shù)［43.00（30.00–88.75）vs. 104.00（73.00–155.25）cells/μL，P＝0.005］及CD8?CD28?CD38?T/CD8?CD28?T%［40.23%（16.67–61.75）vs. 71.10%（49.17–87.17），P＝0.008］則顯著偏低。中等效應(yīng)量出現(xiàn)在NK細(xì)胞計數(shù)、CD8?CD28?CD38?T%、GM-CSF及CD3?CD38?T計數(shù)等指標(biāo)上。值得注意的是，NK細(xì)胞計數(shù)在腹瀉發(fā)生前1周、移植后第4周及第5周均在GVHD與感染組之間存在穩(wěn)定且方向一致的差異，顯示其具有持續(xù)且中等強(qiáng)度的區(qū)分能力（Figure 2）。
圖2. 移植后第 4 周和第 5 周差異變量的單因素分析；A. 移植后第 4 周的差異變量；B. 移植后第 4 周差異變量的效應(yīng)量；C. 移植后第 5 周的差異變量；D. 移植后第 5 周差異變量的效應(yīng)量；注：**表示 P<0.01（差異極顯著），表示*P<0.05（差異顯著）
預(yù)測模型構(gòu)建
4.1 LASSO回歸與Logistic回歸對多因素預(yù)測變量的篩選
LASSO回歸共篩選出5個潛在預(yù)測指標(biāo)，包括IL-4、IL-22、CD3?T%、NK細(xì)胞計數(shù)以及CD4?CD28?/CD4?T%（圖3）。在初始多因素Logistic回歸模型中——logit(P[infection])=0.6162+0.0141×（NK細(xì)胞計數(shù)）?0.0270×（CD4?CD28?/CD4?T%）——模型整體性能良好（P<0.0001，AUC=0.897，Brier=0.135）。其中，CD4?CD28?/CD4?T%為顯著的保護(hù)因素（P=0.0043，95% CI：0.950–0.991），每增加1個單位可使感染風(fēng)險降低約3%，而NK細(xì)胞計數(shù)呈正相關(guān)趨勢（P<0.1）。在進(jìn)一步簡化的雙變量模型中，上述兩項預(yù)測因子依然保持穩(wěn)定的預(yù)測效能（χ2=19.98，df=2，P<0.001；C-統(tǒng)計量=0.799，95% CI：0.66–0.98；Brier=0.162）。
圖3. 采用 LASSO 回歸篩選提前 1 周預(yù)測腹瀉發(fā)生的變量；A. 系數(shù)輪廓圖；B. 調(diào)優(yōu)參數(shù)選擇的交叉驗證結(jié)果
4.2 單時間點雙變量診斷模型的列線圖構(gòu)建與驗證
基于雙變量模型構(gòu)建了一個診斷性列線圖，通過累加各指標(biāo)對應(yīng)的得分用于預(yù)測感染/GVHD的風(fēng)險。該模型表現(xiàn)出良好的校準(zhǔn)度（圖 4A），并在決策曲線分析（DCA）中顯示出較高的臨床凈獲益（圖 4C）。校準(zhǔn)曲線分析顯示模型預(yù)測概率與實際觀察概率之間具有良好一致性（圖 4B）。ROC曲線分析結(jié)果顯示AUC為0.799，最佳截點為0.408（Youden指數(shù)），提示模型具有良好判別能力。在該截點下，模型的敏感度和特異度分別為0.708和0.882，表明其特異度較高而敏感度適中。預(yù)測感染風(fēng)險＞40.8%的患者被歸類為高風(fēng)險人群，需要給予臨床關(guān)注（圖 4D）。
圖 4. 提前1周預(yù)測腹瀉發(fā)生的預(yù)測模型構(gòu)建；A. 基于顯著預(yù)測因子的列線圖；B. 列線圖的校準(zhǔn)曲線；C. 模型的決策曲線分析（DCA）；D. 預(yù)測模型的受試者工作特征曲線（ROC 曲線）
4.3 構(gòu)建多時間點預(yù)測模型（腹瀉發(fā)生前1周、第4周及第5周）
針對多時間點預(yù)測（腹瀉發(fā)生前、第4周和第5周），保留了9個關(guān)鍵預(yù)測因子，并用于構(gòu)建加權(quán)預(yù)測評分（Predicted Score）：
\\text{Predicted Score} = 2.6714 - 0.0116 \\times (\\text{CD8?T% 腹瀉前}) + 0.0049 \\times (\\text{NK 腹瀉前}) - 0.0217 \\times (\\text{CD4?CD28?/CD4?T% 腹瀉前}) - 0.0256 \\times (\\text{Th2/CD4?T% 腹瀉前}) - 0.0005 \\times (\\text{TNFR1 第4周}) + 0.0006 \\times (\\text{NK 第4周}) - 1.6570 \\times (\\text{GM-CSF 第5周}) + 0.0038 \\times (\\text{NK 第5周}) + 0.0243 \\times (\\text{CD3?CD38?T% 第5周})
多因素Logistic回歸分析顯示，Predicted Score每增加1單位，與感染發(fā)生顯著相關(guān)（OR=5.133，95% CI 2.47–14.71，P<0.001）。ROC曲線分析表明模型區(qū)分度優(yōu)異（AUC=0.908，最佳截點=0.669，敏感性0.875，特異性0.794）。Bootstrap內(nèi)部驗證（1000次重復(fù)抽樣）顯示模型具有良好的校準(zhǔn)度與區(qū)分度（C統(tǒng)計量=0.884 [0.880–0.889]）。校準(zhǔn)曲線顯示預(yù)測概率與實際發(fā)生概率高度一致，決策曲線分析則證實了基于該列線圖干預(yù)的臨床凈收益（圖5）。
圖5. 腹瀉發(fā)作的縱向預(yù)測模型；A. 預(yù)后列線圖；B. 列線圖的校準(zhǔn)曲線；C. 模型的決策曲線分析（DCA）；D. 模型與各單個時間點預(yù)測因子的ROC曲線
研究結(jié)論
多時間點動態(tài)免疫監(jiān)測可實現(xiàn)GI-GVHD與病毒性腸炎的早期、準(zhǔn)確鑒別，為allo-HSCT后精準(zhǔn)免疫監(jiān)測及及時干預(yù)提供了有效工具。
03、評估CD19 CAR-T治療后免疫狀態(tài)權(quán)重的細(xì)胞因子評分系統(tǒng)的建立與驗證
標(biāo)題：Development and validation of a weighted cytokine scoring system for immune status Assessment Following CD19 CAR-T Therapy
中文標(biāo)題：CD19 CAR-T療法后免疫狀態(tài)評估的加權(quán)細(xì)胞因子評分系統(tǒng)的開發(fā)與驗證
第一作者：王東出
通訊作者：王卉
背景和目的
本研究建立并驗證了一種新型免疫狀態(tài)評估系統(tǒng)，通過多細(xì)胞因子譜分析技術(shù)客觀評估CD19 CAR-T療法后的免疫反應(yīng)，并助力早期識別細(xì)胞因子釋放綜合征（CRS）。該系統(tǒng)通過量化多種細(xì)胞因子的作用并提出公式化算法，為簡化、科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)且快速評估海量數(shù)據(jù)提供了有效工具。
方法
本研究樣本來自2020年3月起在陸道培醫(yī)院接受CD19 CAR-T療法治療的111例難治性/復(fù)發(fā)性B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血?。˙-ALL）患者。研究隊列包含用于開發(fā)細(xì)胞因子評分系統(tǒng)的訓(xùn)練集（n=34）和用于評估臨床一致性驗證集（n=77）。訓(xùn)練集在六個時間點（CAR-T治療前（第0天）及治療后第4、7、14、21、28天）對24種細(xì)胞因子（IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-10、IL-12p70、TNFα、TNFβ、IL-4、IL-5、IL-8、IL-17A、IL-17F、IL-22、IL-2RA、MCP-1、GM-CSF、IL-15、顆粒酶B、REG3a、ST-2、TNFRI、Elafin和MIP-1α）進(jìn)行連續(xù)檢測。驗證集則在第0天和第7天進(jìn)行細(xì)胞因子譜分析。
結(jié)果
研究發(fā)現(xiàn)，治療后7-10天細(xì)胞因子水平達(dá)到峰值，隨后隨著CAR-T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞相互作用減弱、腫瘤清除進(jìn)程推進(jìn)，細(xì)胞因子濃度逐漸下降。這一下降趨勢與CAR-T細(xì)胞、CD3+和CD8+T細(xì)胞群體增殖放緩?fù)桨l(fā)生，到第30天左右，細(xì)胞因子濃度已回落至接近基線水平。
為便于臨床應(yīng)用，我們開發(fā)了一套細(xì)胞因子評分系統(tǒng)用于評估免疫狀態(tài)（圖1）。24種因子根據(jù)其對細(xì)胞因子釋放綜合征（CRS）預(yù)測的貢獻(xiàn)度分為四個權(quán)重等級：I類細(xì)胞因子（IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-10、ST-2、IL-8、GM-CSF）權(quán)重為2.0；II類（IL-2RA、IL-17F、REG3a、IL-1β、MCP-1、TNFRI）權(quán)重為1.0；III類（IL-4、IL-5、IL-22、IL-15、IL-12p70）權(quán)重為0.5；IV類（Elafin、TNFα、Granzyme B）權(quán)重為-1.0。當(dāng)某細(xì)胞因子的峰值超過閾值的三倍時，該因子會被賦予權(quán)重分。各細(xì)胞因子的得分相加得出總分。根據(jù)靶向治療結(jié)果，免疫狀態(tài)評分≤8分的歸類為CRS 0-1級；評分>8分且<18分的歸類為CRS 2級；評分≥18分的歸類為CRS 3-4級。臨床驗證顯示系統(tǒng)總體靈敏度為89.61%，特異性為96%，陽性預(yù)測值（PPV）為95.83%，陰性預(yù)測值（NPV）為90%。值得注意的是，在區(qū)分0-1級CRS（門診可管理）與≥2級CRS（需按美國腎臟病學(xué)會（ASTCT）標(biāo)準(zhǔn)住院治療）時，該系統(tǒng)表現(xiàn)更優(yōu)：靈敏度達(dá)91.55%，特異性99%，陽性預(yù)測值98.48%，陰性預(yù)測值92%，充分證明其在指導(dǎo)關(guān)鍵臨床決策中的實用價值（表1）。
結(jié)論
該標(biāo)準(zhǔn)化系統(tǒng)為免疫監(jiān)測和早期干預(yù)提供了客觀高效的工具，對細(xì)胞免疫治療的臨床決策支持具有重要價值。
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